PCR (Polymerase Chain Reaction) 即聚合酶鏈?zhǔn)椒?/span>應(yīng),又稱無細胞分子克隆系統(tǒng)或體外酶促基因擴增法。其基本原理類似于 DNA 的天然復(fù)制過程,是在模板 DNA、引物和 4種脫氧核苷酸存在的條件下,依賴于 DNA 聚合酶的酶促合反應(yīng),將待擴增的DNA片段與其兩側(cè)互補的寡核苷酸鏈引物經(jīng)“高溫變性——低溫退火——引物延伸”三步反應(yīng)的多次循環(huán),使 DNA 片段在數(shù)量上呈指數(shù)增加,該技術(shù)可以將極微量的靶DNA 特異地擴增上百萬倍,從而在短時間內(nèi)獲得所需的大量特定基因片段,因此能在臨床上檢測單分子 DNA或每 10 萬個細胞中僅含 1 個靶 DNA 分子的樣品。
二、PCR 實驗室平面布局
根據(jù)《臨床基因擴增檢驗實驗室基本設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定,臨床基因擴增檢驗實驗室需要設(shè)置試劑儲存和準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴增反應(yīng)混合物配制和擴增區(qū)、擴增產(chǎn)物分析區(qū)等四個區(qū)域。如使用全自動分析儀,區(qū)域設(shè)置可以適當(dāng)合并。
雖然 PCR 實驗室的四個功能分區(qū)是固定的,但各醫(yī)院在實際布置中卻千差萬別,其主要布置形式有分散式和集中式兩種。
分散式:各實驗用房彼此相距較遠,呈分散布置形式。各實驗之間不易相互干擾。
集中式:完成 PCR 四個實驗過程的實驗用房相鄰布置,形成集中、獨立的實驗區(qū)域。每個實驗室應(yīng)設(shè)置獨立緩沖間、實驗室間應(yīng)設(shè)置帶消毒裝置的傳遞窗。
在理想情況下,PCR 實驗室緩沖間內(nèi),可設(shè)置正壓,使室內(nèi)空氣不流向室外,室外空氣不流向室內(nèi)。若房間進深允許,可設(shè) PCR 內(nèi)部專用走廊。在減少室內(nèi)外空氣交換方面,緩沖間比專用走廊更有意義。試劑和標(biāo)本通過機械連鎖傳遞窗傳遞,保證試劑和標(biāo)本在傳遞過程中不受污染,達到人、物分流。
三 .PCR 實驗室的主要功能和設(shè)備配置
1. 試劑儲存和準(zhǔn)備區(qū)
該實驗區(qū)主要進行的操作為貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應(yīng)混合液的制備。試劑和用于標(biāo)本制作的材料應(yīng)直接運送至該區(qū),不得經(jīng)過其他區(qū)域。試劑原材料必須貯存在本區(qū)內(nèi),并在本區(qū)內(nèi)制備成所需的貯存試劑。
2. 標(biāo)本制備區(qū)
該區(qū)域主要進行的操作為臨床標(biāo)本的保存、核酸 (RNA、DNA) 提取、貯存及其加入至擴增反應(yīng)管和測定RNA時cDNA 的合成。
本區(qū)的壓力梯度要求為:相對于鄰近區(qū)域為正壓,以避免從鄰近區(qū)進入本區(qū)的氣溶膠污染。另外,由于在加樣操作中可能會發(fā)生氣溶膠所致的污染,所以應(yīng)避免在本區(qū)內(nèi)不必要的走動。
對具有潛在傳染危險性的材料,必須在生物安全柜內(nèi)開蓋,并有明確的樣本處理和滅活程序。
3. 擴增反應(yīng)混合物配制和擴增區(qū)
該區(qū)域主要進行的操作為DNA或cDNA 擴增。此外,已制備的 DNA 模板和合成的 cDNA( 來自樣本制備區(qū) ) 的加入和主反應(yīng)混合液 ( 來自試劑貯存和制備區(qū) ) 制備成反應(yīng)混合液等也可在本區(qū)內(nèi)進行。在巢式 PCR 測定中,通常在第一輪擴增后必須打開反應(yīng)管,因此巢式擴增有較高的污染危險性,第二次加樣必須在本區(qū)內(nèi)進行。
四 .PCR 實驗室空調(diào)通風(fēng)設(shè)計
國際上,世界衛(wèi)生組織(WHO)一直非常重視實驗室生物安全問題,早在 1983 年就出版了《實驗室生物安全手冊》,2003年4月第二版 ( 修訂版 ) 以電子版形式在 WHO 網(wǎng)頁上問世。美國在實驗室的生物安全管理方面更是走在了世界的前列,NIH/CDC 聯(lián)合出版的《微生物學(xué)及生物醫(yī)學(xué)實驗室生物安全準(zhǔn)則》現(xiàn)已推出了第四版。很多國家在制定本國的生物安全準(zhǔn)則時,主要參考上述兩個標(biāo)準(zhǔn)。
我國關(guān)于 PCR 實驗室建設(shè)及管理的現(xiàn)行技術(shù)規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)有以下幾種:
《臨床基因擴增檢驗實驗室工作規(guī)范》;
《醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室管理辦法》衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)【2010】194 號;
《醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室工作導(dǎo)則》;
《生物安全實驗室建筑技術(shù)規(guī)范》 GB50346-2011;
《實驗室生物安全通用要求》GB19489-2008;
《潔凈廠房設(shè)計規(guī)范》GB50073—2013;
《微生物和生物醫(yī)學(xué)實驗室生物安全通用準(zhǔn)則》WS233-2002 中華人民共和國衛(wèi)生部;
實驗室規(guī)范《JGJ91 科學(xué)實驗室建筑設(shè)計規(guī)范》等。